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　　一、熒光顯微鏡標本制作要求

　　(一)載玻片

　　載玻片放大鏡厚度應在0。8～1。2mm之間，太厚的坡片，一方面光吸收多，另一方面不能使激發光在標本上聚集。載玻片必須光潔，厚度均勻，無明顯自發熒光。有時需用石英玻璃載玻片。

　　(二)蓋玻片

　　蓋玻片厚度在0。17mm左右，光潔。為了加強激發光，也可用干涉蓋玻片，這是一種特制的表面鍍有若干層對不同波長的光起不同干涉作用的物質(如氟化鎂)的蓋玻片，它可以使熒光順利通過，而反射激發光，這種反射的激發光女可激發標本。

　　(三)標本

　　組織切片顯微鏡或其他標本不能太厚，如太厚激發光大部分消耗在標本下部，而物鏡直接觀察到的上部不充分激發。另外，細胞重迭或雜質掩蓋，影響判斷。

　　(四)封裱劑

　　封裱劑常用甘油，必須無自發熒光，無色透明，熒光的亮度在pH8。5～9。5時較亮，不易很快褪去。所以，常用甘油和0。5mol/l pH9。0～9。5的碳酸鹽緩衝液的等量混合液作封裱劑。

　　(五)鏡油

　　一般暗視野熒光顯微鏡和用油鏡觀察標本時，必須使用鏡油，最好使用特制的無熒光鏡油，也可用上述甘油代替，液體石蠟也可用，只是折光率較低，對圖像質量略有影響。

　　二、使用熒光顯微鏡的注意事項

　　(1)嚴格按照熒光顯微鏡出廠說明書要求進行操作，不要隨意改變程序。

　　(2)應在暗室中進行檢查。進入暗室後，接上電源，點燃超高壓汞燈5～15min，待光源發出強光穩定後，眼睛完全適應暗望遠鏡室，再開始觀察標本。

　　(3)防止紫外線對眼睛的損害，在調整光源時應戴上防護眼鏡。

　　(4)檢查時間每次以1～2h為宜，超過90min，超高壓汞燈發光強度逐漸下降，熒光減弱；標本受紫外線照射3～5min後，熒光也明顯減弱；所以，最多不得超過2～3h。

　　天文望遠鏡(5)熒光顯微鏡光源壽命有限，標本應集中檢查，以節　省時間，保護光源。天熱時，應加電扇散熱降溫，新換燈泡應從開始就記錄使用時間。燈熄滅後欲再用時，須待燈泡充分冷卻後才能點燃。一天中應避免數次點燃光源。

　　(6)標本染色後立即觀察，因時間久了熒光會逐漸減弱。若將標本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延緩熒光減弱時間，防止封裱劑蒸發。

　　(7)熒光亮度的判斷標准：一般分為四級，即“一”—無或可見微弱熒光。“+”—僅能見明確可見的熒光。“++”—可見有明亮的熒光。“+++”—可見耀眼的熒光。

　　三、熒光圖像的記錄方法

　　熒光顯微鏡所看到的熒光圖像，一是具有形態學特征，二是具有熒光的顏色和亮度，在判斷結果時，必須將二者結合起來綜合判斷。結果記錄根據主觀指標，即憑工作者目力觀察。作為一般定性觀察，基本上可靠的。隨著技術科學的發展，在不同程度上采用客觀指標記錄判斷結果，如用細胞分光光度計，圖像分析儀等儀器。但這些儀器記錄的結果，也必須結合主觀的判斷。

　　熒光顯微鏡攝影技術對於記錄熒光金相顯微鏡圖像十分必要，由於熒光很易褪色減弱，要即時攝影記錄結果。方法與普通顯微攝影技術基本相同。只是需要采用高速感光膠片如ASA200以上或24。以上。因紫外光對熒光猝滅作用大，如FITC的標記物，在紫外光下照射30s，熒光亮度降低50%。所以，曝光速度太慢，就不能將熒光圖像拍攝下來。一般研究型熒光顯微鏡都有半自動或全自動顯微攝影系統裝置。

　　阿貝聚光鏡(Abbe conde顯微鏡nser)

　　這是由德國光學大學大師恩斯特•阿貝(Ernst Abbe)設計。阿貝聚光鏡由兩片透鏡組成，有較好的聚光能力，但是在物鏡數值孔徑高於0。60 時，則色差、球差就顯示出來。因此，多用於普通顯微鏡上。

　　消色差聚光鏡(Achromatic aplanatic condenser)

　　這種聚光鏡放大鏡又名“消色差消球差聚光鏡”和“齊明聚光鏡”，它由一系列透鏡組成，對色差球差的校正程度很高，能得到理望遠鏡想的圖像，是明場鏡檢中質量最高的一種聚光鏡，其NA值達1。4 。因此，在高級研究顯微鏡常配有此種聚光鏡。它不適用於4×以下的低倍物鏡，否則照明光源不能充滿整個視場。

　　搖出式聚光鏡(Swing out condenser)

　　4×)，由於視場大，光源所形成的光錐不能充滿整個視場，造成視場邊緣部分黑暗，只中央部分被照亮。要使視場充滿照明，就需將聚光鏡的上透鏡從光路中搖出。

　　暗視野聚光鏡

　　用於暗視野照明。

　　相差聚光鏡

　　用於觀察無色透明樣本的相差聚光鏡，要配合相差物鏡使用，倒置顯微鏡上用的幾天文望遠鏡乎都是相差聚光鏡。正置顯微鏡則會根據用戶要求選配。

　　微分干涉聚光鏡

　　該聚光鏡是最復雜的金相顯微鏡一種，也可以叫多功能聚光鏡，因為它一般可以實現：明視野，暗視野，相差，DIC等幾乎所有觀察方式的照明。只有高檔研究用顯微鏡才配置這種聚光鏡。

　　顯微顯微鏡的使用方法

　　1。低倍鏡的使用方法

　　(1放大鏡)取鏡和放置：顯微鏡平時存放在櫃或箱中，用時從櫃中取出，右手緊握鏡臂，左一手托住鏡座，將顯微鏡放在自己左肩前方的實驗台上，鏡座後端距桌邊1-2寸為宜，便於坐著操作。

　　(2)對光：用拇指和中指移動旋轉器(切忌手持物鏡移動)，使低倍鏡對准鏡台的通光孔(當轉動聽到碰叩聲時，說明物鏡光軸已對准鏡筒中心)。打開光圈，上升集光器，並將反光鏡轉向光源，以左眼在目鏡上觀察(右眼睜開)，同時調節反光鏡方向，直到視野內的光線均勻明亮為止。

　　顯微鏡(3)放置玻片標本：取一玻片標本放在鏡台上，一定使有蓋玻片的一面朝上，切不可放反，用推片器彈簧夾夾住，然後旋轉推片器螺旋，將所要觀察的部位調到通光孔的正中。

　　(4)調節焦距：以左手按逆時針方向轉動粗調節器，使鏡台緩慢地上升至物鏡距標望遠鏡本片約5毫米處，應注意在上升鏡台時，切勿在目鏡上觀察。一定要從右側看著鏡台上升，以免上升過多，造成鏡頭或標本片的損壞。然後，兩眼同時睜開，用左眼在目鏡上觀察，左手順時針方向緩慢轉動粗調節器天文望遠鏡，使鏡台緩慢下降，直到視野中出現清晰的物像為止。

　　如果物像不在視野中心，可調節推片器將其調到中心(注意移動玻片的方向與視野物像移動的方向是相反的)。如果視野內的亮度不合適，可通過升降集光器的位置或開閉光圈的大小來調節，如果金相顯微鏡在調節焦距時，鏡台下降已超過工作距離(>5。40mm)而未見到物像，說明此次操作失敗，則應重新操作，切不可心急而盲目地上升鏡台。

　　2。高倍鏡的使用方法

　　(1)選好目標：一定要先在低倍鏡下把需進一步觀察的部位調到中心，同時把物像調節到最清晰的程度，才能進行高倍鏡的觀察。

　　(2)轉動轉換器，調換上高倍鏡頭，轉換高倍鏡時轉動速度要慢，並從側面進行觀察(防止高倍鏡頭碰撞玻片)，如高倍鏡頭碰到玻片，說明低倍鏡的焦距沒有調好，應重新操作。

　　(3)調節焦距：轉換好高倍鏡後，用左眼在目鏡上觀察，此時一般能見到一個不太清楚的物像，可將細調節器的螺旋逆時針移動約0。5-1圈，即可獲得清晰的物像(切勿用粗調節器！)

　　如果視野的亮度不合適，可用集光器和光圈加以調節，如果需要更換玻片標本時，必須順時針(切勿轉錯方向)轉動粗調節器使鏡台下降，方可取下玻片標本。

　　3。油鏡的使用方法

　　(1)在使用油鏡之前，必須先經低、高倍鏡觀察，然後將需進一步放大的部分移到視野的中心。

　　(2)將集光器上升到最高位置，光圈開到最大。

　　(3)轉動轉換器，使高倍鏡頭離開通光孔，在需觀察部位的玻片上滴加一滴香柏油，然後慢慢轉動油鏡，在轉換油鏡時，從側面水平注視鏡頭與玻片的距離，使鏡頭浸入油中而又不以壓破載玻片為宜。

　　(4)用左眼觀察目鏡，並慢慢轉動細調節器至物像清晰為止。

　　如果不出現物像或者目標不理想要重找，在加油區之外重找時應按：低倍→高倍→油鏡程序。在加油區內重找應按：低倍→油鏡程序，不得經高倍鏡，以免油沾污鏡頭。

　　在實際操作中，偏光顯微鏡的上下偏振鏡的振動顯微鏡方向要互相正交，或東西和南北方放大鏡向，各自與目鏡十字絲的橫、縱向一致。有時只用一個下偏望遠鏡振鏡來觀測，必須確定下偏振鏡的振動方向，因此操作時必須對偏振鏡進行校正。

　　(1)目鏡十字絲的檢測

　　一般要檢查目鏡十字絲是否正交，以及是否與上下偏振鏡振動天文望遠鏡方向一致，同時選一塊解理極完全的黑雲母，移至目鏡十字絲的中心，將解理縫平行於十字絲的一根絲，記下載物台的刻度數，再轉動物台使解理縫平行於另一十字絲，記下載物台的刻度數，兩個刻度數之差為90°，說明十字絲正交。

　　(2)下偏振鏡振動方向的確定和校正

　　一般用黑雲母來檢查下偏振鏡的振動方向，這是因為黑雲母是一種分布廣泛的透明礦物，在單偏光下很有特征。首金相顯微鏡先找一塊解理和清晰的黑雲母，移至目鏡十字絲中心，推出上偏光鏡，轉動載物台一周，觀察黑雲母顏色的變化，因為黑雲母對解理方向的振動光吸收最強，所以使黑雲母顏色達到最深時，解理縫的方向就是下偏光鏡的振動方向。

　　(3)上下偏振鏡正交的校正

　　下偏振鏡的方向校正好之後，取下薄片，推人上偏振鏡，觀察視域是否全黑即是否處於消光狀態。如果全黑，則表明上下偏光的振動方向互相正交。否則，上偏振鏡須進行校正，即轉動上偏振鏡，使視域達到最暗為止。轉動時必須先松開上偏振鏡的止動螺絲，校正好後再擰緊。

　　　用來觀察物體細節的簡單目視光學器件，是焦距比眼的明視放大鏡距離小得多的會聚透鏡。物體在人眼視網膜上所成像的大小正比於物對眼所張的角(視角)。視角愈大，像也愈大，愈能分辨物的細節。移近物體可增大視角，但受到眼睛調焦能力的限制。使用放大鏡，令其緊靠眼睛，並把物放在它的焦點以內，成一正立虛像。放大鏡的作用是放大視角

　　原理

　　為看清楚微小的物體或物體的細節，需要把物體移近眼睛，這樣可以增大視角，使在視網膜上形成一個較大的實像。但當物體離眼的距離太近時，反而無法看清楚。換句話說話，要明察秋毫，不但應使顯微鏡物體對眼有足夠大的張角，而且還應取合適的距離。顯然對眼睛來說，這兩個要求是相互制約的，望遠鏡若在眼睛前面配置一個凸透鏡便能解決這一問題。凸透鏡是一個最簡單的放大鏡，是幫助眼睛觀察微小物體或細節的簡單的光學儀器。

　　現以凸透鏡為例，計算它的放大本領。把物體PQ置於透鏡L的物方焦點和透鏡之間並使它靠近焦點，如圖2-20(a)所示，於是物體經透鏡成一放大的虛像P′Q′。為了便於觀察，通常使虛像位於明視距離處。

　　P′Q′對眼的視角近似為若不用透鏡而將物置於明視距離處時，從瞳孔看物的視角為(y以cm為單位) (2—3)於是透鏡的放大本領為 (f′以cm為單位) (2—4)

　　若凸透鏡的像方焦距為10cm，則由該透鏡做成的放大鏡的放大本領為2。5倍，寫成2。5×。如果僅從放大本領來考慮，焦距應該取得短一些，而且似乎這樣可以得到任意大的放大本領。但由於像差的存在，一般采用的放大本領約為3×。如果采用復式放大鏡(如目鏡天文望遠鏡)，則可以減少像差，並使放大本領達到20×。

　　聚焦放大鏡

　　focusing magnifier

　　裝在雙鏡頭反光相機的聚焦罩上的放大鏡。便於復印或顯微鏡攝影當時需要精確對焦。供單鏡頭反光相機使用時，裝在目鏡上使用

　　用來觀察物體細節的簡單目視光學器件，是焦距比眼的明視距離小得多的會聚透鏡。物體在人眼視網膜上所成像的大小正比於物對眼所張的角(視角)。視角愈大，像也愈大，愈能分辨物的細節。移近物體可增大視角，但受到眼睛調焦能力的限制。使用放大鏡，令其緊靠眼睛，並把物放在它的焦點以內，成一正立虛像。放大鏡的作用是放大視角。

　　虛像與實像的區別：實像：物體上某點發出(或反射、折射)的光，經過面鏡、透鏡的反射，折射的實際光線如果是會聚的，其會聚點我們叫物體上某點的實像點。對應於物體上每一個物點都有一個實像點。與物體上各物點相對應的所有實像點的集合，就是物體的實像。實像可以在光屏上呈現出來，如照相機底片上所成的就是實像。

　　虛像：由面鏡成透鏡反射或折射的實際光線如果是發散的金相顯微鏡，則它們不可能會聚，它們的反向延長線的會聚點，就是虛像點。摘自：MDSIN麥森中國區產品服務中心(mdsin#com)。所有虛像點的集合，就是物體的虛像。虛像不能呈現在光屏上，但可以用眼睛直接觀察到。

　　明視場顯微鏡

　　與常規的明視場顯微顯微鏡鏡，光從白熾源通過一第二放大透鏡，眼或目鏡旨在朝向透鏡下方的載物台稱為聚光鏡，通過樣品，通過一個物鏡，並且通過一對目鏡，再到人眼。我們看到在光路中的對像，因為天然色素或污漬吸收光的差異，或者是因為它們是足夠厚以吸收顯著光量盡管是無色的。一個草履蟲應顯示相當不錯的一個明視場顯微鏡，雖然它不會很容易地看到纖毛或大部分細胞器。活菌不會出現，除非是觀眾打焦平面靠運氣，並通過使用最大對比度失真的圖像。

　　良好的質量顯微鏡具有一個內置的照明器，可調節聚光用孔徑光闌(對比度)控制，機械的載物台，和雙目目鏡筒。聚光鏡用於通過在載物台中的開口，以將光聚焦在樣品上。穿過樣品後，光被顯示給眼睛的表觀視場比照明的區域大得多。圖像的倍率是簡單的物鏡放大倍數(通常印在鏡體)倍目鏡倍率。

　　通常知道使用的粗，細對焦旋鈕，用來增強標本的形像。它們常常不知道調整會影響分辨率和對比度的聚光鏡。一些聚光鏡被固定在適當的位置，其它的是可聚焦，使得光的質量可以調節。通常對於一個聚焦的聚光鏡的最佳位置是盡量靠近載物台的可能。明場聚光鏡通常包含孔徑光圈，一個控制所述光束上來通過聚光鏡的直徑，使得當隔膜被停止下來(幾乎封閉)的光穿過聚光透鏡的中心來直線上升裝置和對比度高。當隔膜是敞開的圖像更明亮，對比度低。

　　不必僅僅依靠孔徑光闌對比度的缺點是，超過最佳點更多的對比你生產的越多，扭曲的形像。具有體積小，未染色，未染色的標本，你通常都是過去的最佳對比度，當你開始看到的圖像。

　　放大鏡使用明場顯微鏡

　　首先，想想你想要做顯微鏡什麼。什麼是你需要的最大放大倍率?你在看一個染色標本?多少對比度/分辨率，你需要?接下來，開始設置進行查看。

　　安裝樣品在載物台上

　　蓋玻片必須啟動，如果有一個。高望遠鏡倍物鏡無法通過厚厚的玻璃載玻片重點； 它們必須被帶到靠近樣品，這就是為什麼蓋玻片是如此之薄。該載物台可配備有簡單的夾子(不太昂貴的顯微鏡)，或者用某種類型的滑動架的。滑動可能需要手動定位，或有可能是一個機械的載物台(優選)，允許精確定位而不觸及載玻片。

　　顯微鏡的使用方法

　　優化照明

　　光源應具有一個寬的動態範圍，以提供高強度的照明，在高放大倍率和較低的強度，使得用戶可以以低倍率查看舒服。更好顯微鏡具有一個內置的照明器，並且最好顯微鏡具有超過光強度和光束形狀的控制。如果您的顯微鏡需要外部光源中，確保光旨在向聚光鏡的中部。調整照明，使該領域是光明的，不傷眼睛。

　　調節聚光鏡

　　調整和對准顯微鏡，通過閱讀說明書開始。如果沒有手動可用，請嘗試使用這些准則。如果聚光鏡是可聚焦，用鏡頭盡量靠近開口的載物台，你可以把它天文望遠鏡放置它。如果聚光鏡具有可選擇的選項，將其設置為亮場。先從光圈停了下來(高對比度)。你應金相顯微鏡該看到，當您移動孔徑光闌杆，來了通過樣品改變亮度的光。

　　想想你在找什麼

　　這是一個很大很難找到的東西時，你有沒有期望，它的美觀。它有多大?將它移動?它是色素或染色，如果是這樣是什麼顏色?你在哪裡期望找到它在載玻片?例如，通常有很多的麻煩找染細菌，因為用肉眼和低倍率的東西，看起來像污垢。它有助於知道，因為塗片干倒他們通常會留下戒指，這樣一抹黑的邊緣通常具有細胞最密集的濃度。